Der Rio Negro entsteht aus dem Zusammenfluss der beiden Quellflüsse Río Guainía, der seit 1884 als der Oberlauf des Río Negro angesehen wird, und des etwas größeren Río Casiquiare, der als Brazo Casiquiare vom nordwärts durch Venezuela strömenden oberen Orinoco abzweigt und dabei die bedeutendste Flussbifurkation der Erde bildet.

Die Quellregion des Río Guainía liegt im Südosten von Kolumbien im Departamento Guainía, von wo er anfangs nach Osten fließt, um später nach Süden einzuschwenken und die Grenze von Kolumbien und Venezuela zu bilden. Das Flussgebiet ist sehr niederschlagsreich und kaum besiedelt. Der Flusslauf ist nur gering in die Granite und Migmatite des hier hügeligen Guayana-Schildes eingeschnitten. Gelegentlich wird der oberste Río Negro bis zur Grenze nach Brasilien auch noch als Río Guainía bezeichnet.

Der Río Casiquiare zweigt mit einer Wasserführung von etwa 250 m³/s im Bereich eines großen Schwemmfächers vom oberen Orinoco ab. Zahlreiche, besonders von links kommende Nebenflüsse lassen den zunächst nur rund 100 Meter breiten Fluss schnell anwachsen. Der größte ist der an Stromschnellen reiche Río Siapá (auch Shukuminakëu „Fluss der Wellensittiche“) mit einer Länge von über 410 Kilometern. Dieser Klarwasserfluss führt an der Einmündung mehr Wasser und kann hinsichtlich des Wasservolumens als Hauptquellast des Río Casiquiare gelten. Er ist bekannt als Siedlungsraum indigener Völker wie der Yanomami und auch für seine artenreiche Gewässerfauna. Im Einzugsgebiet des zweitgrößten Nebenflusses, des Río Pacimoni, befindet sich eine weitere Flussbifurkation, die eine Gewässerverbindung direkt zum mittleren Rio Negro herstellt.

Nördlich der venezolanischen Stadt San Carlos de Río Negro vereinigen sich Rio Guainía und Rio Casiquiare zum Rio Negro. Hier bildet der Fluss die Grenze zwischen Venezuela und Kolumbien. Beide Quellflüsse scheinen annähernd gleich groß zu sein.